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真核生物のキャップ/ポリA、または原核生物のUTRの除去によるRNA分解はどのくらい重要ですか?

真核生物のキャップ/ポリA、または原核生物のUTRの除去によるRNA分解はどのくらい重要ですか?


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質問はかなり自明ですが、2つの部分に分かれています。私は、リボザイムを分解する(または単に不活性化する)ことを目的として、特定の領域でRNAを切断するリボザイムを使用する抑制システムを利用しようとしています。

このシナリオは、真核生物では5'UTRに上限があり、3 'UTRにpolyAテールがあり、RNAの安定性に役立つため、より可能性が高いようです。 キャップのないRNAはどれくらい速くそしてどれくらい分解しますか? polyAテールの欠如はどうですか?

原核生物はこれらの構造を欠いているため、特定の例ではUTR領域の使用に制限されています。 一般的であろうと特定のタンパク質であろうと、原核生物のRNA不活性化のためにUTR領域を利用することを可能にする同様のメカニズムはありますか? これらのUTR領域に合成配列を追加することは確かに可能性があることを覚えておいてください。


Xrn1 / 2などの5 '→3'エキソヌクレアーゼによる分解には5 'キャップの除去が不可欠です。 Xrn1 / 2は構成的であり、キャップのないRNAの分解は非常に高速です(正確な寿命のリファレンスはありません)。デデニル化は一般的にエクソソームによる3 '→5'分解に先行しますが、それが前提条件であるかどうかはわかりません。ただし、テールレスmRNAは、Pab1p(ポリA結合タンパク質)を3'UTRにつなぐことで安定化できます。このペーパーを参照してください。

リンクされた論文の図4。

テザードPab1pは、テールを受け取らないmRNAを安定化します。 (A)戦略。 HDV自己切断リボザイムをMFA2 / MS2RNAの3'UTRに挿入し、in vivoでポリ(A)テール(A0)のないmRNAを生成しました。 (B)オリゴ(dT)セルロースクロマトグラフィー。 RNAは、Aに示されているリボザイム含有コンストラクト、または前の図で使用されているコントロールプラスミドを保持する細胞から抽出されました。 RNAをオリゴ(dT)セルロースクロマトグラフィーで分画し、ノーザンブロッティングで分析しました。リボザイムを含むRNAはカラムに保持されませんが、コントロールRNAは保持されます。 (T)分画前のトータルRNA; (+)列によって保持されます。 (-)列に保持されません。レーンごとにロードされるRNAが少ないため、mRNAはオリゴ(dT)保持(+)サンプルの方がトータル(T)RNAよりもわずかに速く実行されます。 (C)S1ヌクレアーゼ分析。リボザイムを含むRNAを保有する株から調製されたmRNAの3 '末端は、S1ヌクレアーゼマッピングによって決定された。未消化のプローブ(65ヌクレオチド)と保護された種(43ヌクレオチド)の位置が示されています。顕著な3 '末端は、リボザイム切断の予想される位置にあります。 (D)転写パルスチェイス実験およびノー​​ザンブロッティングによるリボザイム切断RNAの崩壊。リボザイムで切断されたレポーターmRNAの代謝回転率は、MS2 / Pab1pを含む(左)または含まない(右)株で決定されました。転写抑制後の時間(分)は上部に直接示されています。半減期は一番下にあります。 (E)結果の定量化。 mRNAの量は、Dの各レーンの下部にある18S rRNAのレベルに正規化されました。(•)MS2 / Pab1p; (○)ベクターのみ。

原核生物のUTRには一般的なパラダイムはありません。原核生物のシステムでmRNAの不活化を制御するには、リボスイッチまたはシス抑制RNA(RBS相補的RNA)を使用できます。 RNAガイドRNA分解は、CRISPR-Casシステムを使用した原核生物でも可能です。このペーパーを参照してください。この活動にはタンパク質Cmr-1,2,3,4&6が必要です。


バイオ第14章

上の図で局所的に巻き戻されたDNAの二本鎖を考えると、転写中にRNAポリメラーゼはどの方向に、どの鎖で移動しますか?

タンパク質の活性部位をコードするエクソンの単一ヌクレオチドの欠失

すべてまたはほとんどのイントロンの重複

非テンプレート鎖の3 '末端から1コドン離れたフレームシフト変異

遺伝子は特定の酵素の産生を決定し、影響を受けた個人は特定の酵素を欠く原因となる遺伝的欠陥を持っています。

多くの代謝酵素は補因子としてDNAを使用しており、影響を受けた個人には、酵素がDNAと効率的に相互作用するのを妨げる突然変異があります。

特定の代謝反応はリボザイムによって実行され、影響を受けた個人は重要なスプライシング因子を欠いています。

転写プロセスの一部としてRNAを合成する酵素

RNAを基質として使用する酵素

大小のリボソームサブユニット間の会合を触媒する酵素

塩基の挿入または削除

mRNAは核から輸送されません。

分子は核内の制限酵素によって消化されます。

分子は5 '末端と3'末端で保護されなくなったため、加水分解酵素によって分解されます。

各アミノ酸をコード化するには、多くのヌクレオチドが必要です。

mRNAの始まり近くに終結エクソンがあります。

遺伝暗号には冗長性があります。

GGGコドンの最初のヌクレオチドの置換

2つのヌクレオチドの削除

早期の転写終結

mRNAへのI1の包含

タンパク質の異なるアミノ酸を置換する可能性があり、その機能が変化する可能性があります。

あるセリンコドンを別のセリンコドンに交換する可能性があります。

ある終止コドンを別の終止コドンと交換する可能性があります。

これは、RNAポリメラーゼのDNAへの結合をコードする配列です。

修飾グアニンをmRNAの3 '末端に付加します。

これは、翻訳終了のサイトを示します。

シーケンスは非常に急速に進化します。

シーケンス内のすべての変異が選択されます。

この配列は、すべてではありませんが多くのプロモーターに見られます。

それは転写の速度を増加させます。

単一のmRNAからさまざまなタンパク質産物を生成することができます。

これは、転写速度を上げることができるメカニズムです。

転写が開始されると、RNAポリメラーゼは染色体の終わりに到達するまで転写します。

RNAポリメラーゼはターミネーター配列を介して転写し、ポリメラーゼをDNAから分離させ、転写物を放出させます。

RNAポリメラーゼはイントロンを介して転写し、これによりポリメラーゼは転写物を手放します。

アミノ酸が不足しているポリペプチド

原核生物には少なくとも3種類のRNAポリメラーゼがありますが、真核生物には1種類しかありません。

真核生物と原核生物はどちらも、転写を停止するためにポリアデニル化シグナルを認識します。

原核生物と真核生物の両方のRNAポリメラーゼは、同じRNA分子を生成します。

各遺伝子は1つのタンパク質をコードします。

種は高度に進化しています。

エクソンは無傷のままであるため、5'UTRの除去は効果がありません。

I1がUTRとして機能するため、最初のエクソンは読み取られません。

5'UTRを除去すると、5 'キャップも除去されるため、mRNAは加水分解酵素によって急速に分解される可能性があります。

遺伝子発現は、タンパク質がRNAの合成を指示するプロセスです。

遺伝子発現は、DNAがタンパク質の合成を指示するプロセスです。

遺伝子発現は、タンパク質がDNAの合成を指示するプロセスです。

他のトリプレットから空間的に分離されたトリプレット

アミノ酸の付着部位からtRNAの反対側の端にあるトリプレット

アップストリームAUGと同じリーディングフレームのトリプレット

転写中に生成されたRNAは、両方のタイプの生物で修飾されます。

翻訳は、原核生物では転写がまだ進行中の間に開始できますが、真核生物では開始できません。

転写と翻訳は、両方の生物で同時に発生する可能性があります。

mRNA、tRNA、rRNAが転写されます。

翻訳がポリペプチドの最初のいくつかのアミノ酸を組み立てるとすぐに、転写を開始することができます。

ポリAテールがmRNAの3 '末端に追加され、キャップが5'末端に追加されます。


結果

ホモポリマーまたはヘテロポリマーのテールを含む断片化された28SrRNA分子は、ヒト細胞の細胞質と核の両方に存在します。

以前の研究では、ホモポリマーまたはヘテロポリマーのテールを含むトランケートされた28Sおよび18S rRNAを検出しました(18)。これらのrRNAフラグメントが前述の核プロセスの分解中間体である可能性はありますが、2番目のオプションは無視できませんでした:細胞質内のRNAの一時的な、おそらく分解を支援するアデニル化、安定したポリ(A)テールとの共存この細胞の位置を特徴づける。したがって、私たちの最初の目標は、これらの尾のある、切り詰められた分子が核、細胞質、またはその両方に存在するかどうかを判断することでした。

RNAおよびタンパク質は、HeLa細胞から調製された細胞質および核画分から得られました。全RNA、細胞質RNA、および核RNAの臭化エチジウム染色で、成熟rRNAおよびpre-rRNA(およびtRNA)の明確な画分特異的分布が観察されました(図S1)。画分の純度を評価するために、ノーザンブロットとイムノブロットを調製しました。NS は、RNAおよびタンパク質マーカーが対応する画分でのみ検出されたことを示しています。次に、断片化されたポリアデニル化28S rRNAの存在を、オリゴ(dT)RT-PCRによって評価しました。結果は、核と細胞質の両方にホモポリマーまたはヘテロポリマーの伸長を伴う28S rRNAフラグメントを明らかにしました(図1NS)。私たちの知る限り、これはヒト細胞の細胞質で内部的にアデニル化されたRNAの最初の検出です。

ヒト細胞の細胞質および核にホモポリマーまたはヘテロポリマーのポリ(A)テールを持つ28SrRNAフラグメント。 ((NS)分画純度は、免疫ブロット(IB)および画分特異的マーカー:C、細胞質:GAPDHを使用したRNAブロットによって決定されました。 N、核:ヒストンH3(H3)、フィブリラリン、およびU2 / U3 / U5-snoRNA。 T、全細胞RNA /タンパク質。 ((NS)cyt(上)およびnuc(下)画分からのトランケートされたアデニル化28S rRNA分子のオリゴ(dT)RT-PCR分離。 28S rRNAは、プライマーの位置を示す矢印とテールサイトとコンテンツを示す垂直線で概略的に示されています(表S1)。 ((NS)cyt(上)およびnuc(下)画分からのトランケートされた28SrRNA分子のcRT-PCR分離。 「A」がエンコードされているか、転写後に追加されているかがわからない場合は、アスタリスクでマークされます(表S2)。

poly(A)エクステンションに偏らない方法で両方のフラクションのトランケートされた分子を評価するために、環状逆転写(cRT)を28S rRNAの同じ領域に適用しました(図1NS)。切り詰められた分子は、細胞質画分と核画分の両方から首尾よく単離された。ほとんどのフラグメントはテールレスでしたが、少数は1〜4 ntの伸長を持っていましたが、アデノシンがコード化された配列の一部であるか、転写後に追加されたかが明確でない場合があります。これらの分子は、オリゴ(A)の付加を反映している可能性があります。または、テール合成の前の段階か、3'-5 '分解の最中のいずれかである可能性があります。したがって、一過性アデニル化に関するこれまでの多くの研究と同様に、オリゴ(dT)RT-PCRなどの偏った方法は、長い内部テールを表示し、それらのnt組成を評価するために必要であり、ポリアデニル化因子の同一性につながることがよくあります(7、19 )。

ホモまたはヘテロポリマーテールを含む、トランケートされたイントロンの少ないβ-アクチン転写産物。

rRNAに加えて、mRNAがこのプロセスを経ることができるかどうかを確認するために、オリゴ(dT)RT-PCRを使用して短縮型アデニル化β-アクチンmRNA分子の存在を分析しました。遺伝子特異的プライマーが適用され、その一部はイントロンのすぐ上流のmRNA配列を標的とし、スプライシングされたアデニル化β-アクチンフラグメントとスプライシングされていないアデニル化β-アクチンフラグメントの両方の単離を可能にする可能性があります。図2に示すようにNS、トランケートされたアデニル化β-アクチンフラグメントが単離され、rRNAと同様に、ホモポリマーとヘテロポリマーの両方のテールが観察されました。また、そのような分子は核画分と細胞質画分の両方から得られました(表S1)。単離された配列の中にイントロンは存在せず、これらが(完全ではないにしても部分的に)スプライシングされた転写物であることを明らかにした。これらの結果は、rRNAと同様に、mRNAが一過性のアデニル化を受ける可能性があることを示しています。

(NS)ヒト細胞から単離された、ホモポリマーまたはヘテロポリマーのポリ(A)テールを有するスプライシングされたβ-アクチンフラグメント。一次β-アクチンmRNAが概略的に示されています(イントロンは黒、エクソンは灰色)。各エクソン/イントロンの長さが表示されます。ホモポリマーテールとヘテロポリマーテールは、それぞれ遺伝子の上と下に表示されます(表S1)。 ((NS)トランスフェクションの4時間後のHeLa細胞からのオリゴ(dT)RT-PCRによるトランケートされたアデニル化VV RNA分子[G8R(ウイルスmRNA)およびGFP(ウイルスゲノムに組み込まれる)]の分離(表S3)。

ホモポリマーまたはヘテロポリマーの尾を有する短縮型ワクシニアウイルスRNAが感染細胞から単離された。

分画純度アッセイに加えて(図1NS)、前述のように細胞質画分から得られたRNA分子が、in vivoまたは実験手順中に細胞質に「漏出した」核プロセスの中間体ではないことをさらに確認するために、追加のアプローチを採用しました:ワクシニアウイルス( VV)はポックスウイルスファミリーに属し、200を超えるタンパク質をコードする二本鎖DNAゲノムを含んでいます。ポックスウイルスは、ライフサイクル全体を通して核に侵入しないという点で、ほとんどのDNAウイルスの中で独特です(20)。ウイルスRNAが細胞質内で一過性のアデニル化を受けるかどうかを確認するために、感染したHeLa細胞からRNAを精製し、ウイルスゲノムにコードされている遺伝子のトランケートされたポリアデニル化転写物の存在を分析しました。図2NS ウイルスゲノムに挿入されたGFP遺伝子から生成された中間ウイルス遺伝子であるG8RmRNAとGFPmRNAの解析結果を表示します(21)。ホモポリマーまたはヘテロポリマーのテールを持つ、これらの遺伝子に由来するトランケートされた転写物が検出されました。これらの結果は、一過性のRNAポリアデニル化が関与するメカニズムが細胞質に存在し、rRNAだけでなくmRNAにも適用されるという追加のサポートを提供します。したがって、次のステップは、このような分子が見つかった以前に研究されたすべてのシステムと同様に、このタイプのRNAアデニル化とRNA崩壊の間に関連があるかどうかを確認することでした。

トランケートされたポリアデニル化転写物の分解は中間体ですか?

トランケートされたアデニル化RNA分子が検出されたすべてのシステムで、それらは後にポリ(A)支援RNA崩壊経路の中間体であることが示されました。ここで観察された細胞質の尾は、確かにそのようなプロセスの明らかな兆候であるかどうかを尋ねました。もしそうなら、細菌、植物ミトコンドリア、および酵母とヒト細胞の核で観察されるように、エキソヌクレアーゼ活性の阻害はそれらの蓄積をもたらすでしょう(12-14、22)。この目的のために、RNAiを使用してhXrn1とエクソソームサブユニットをノックダウン(KD)しました。後者については、エキソソームに関連するエキソリボヌクレアーゼであるPM / Scl-100およびエクソソームコアタンパク質であるhRrp41を標的とした。イムノブロットは、標的タンパク質の有意なKDを明らかにしました(図3NS)。エクソソーム活性の低下は、PM / Scl-100およびhRrp41サイレンシング細胞の両方における5.8SrRNA前駆体の蓄積によって検証されました(図3NS) (13, 23).

エクソソームサブユニット、hXrn1、hXrn2、およびLsm1のRNAiを介したサイレンシング。 ((NS)サイレンシングの効率は、特定の抗体を用いたイムノブロットを介して測定されました。 ((NS)エクソソーム活性の喪失は、ノーザンブロットによって検出された5.8SrRNA前駆体の蓄積によって検証されました。 ((NS)抗体が利用できなかったRNAiサイレンシングタンパク質のKD効率をRT-PCRでモニターしました。イムノブロットおよびRT-PCRはβ-アクチンで標準化されました。

分解中間体は豊富ではなく、急速に分解されるため、そのような関連分子の高度に発現された転写物を分析することは有益です。したがって、前述のように、オリゴ(dT)RT-PCRによってアデニル化フラグメントが単離された28SrRNAの領域に焦点を当てることを選択しました。断片化されたアデニル化された28SrRNAの蓄積を視覚的に評価するために、放射性標識アッセイを適用し、RT-PCRを介してB2M mRNAに従ってローディング量を正規化しました(図4NS)。オリゴ(dT)逆転写に続いて、トランケートされた分子が以前に単離されたのと同じプライマーが使用されましたが、今回は、生成物が5 '末端[32P] 28SrRNAプライマーを介して標識される追加のPCRステージが含まれました。 。変性ポリアクリルアミドゲルでの分画により、標識された増幅産物の蓄積を高感度で評価できました。トランケートされた分子は28SrRNAに沿ったさまざまな部位でポリアデニル化されたため(図1NS)、および拡張の長さが異なる場合、蓄積によって単一のバンドが発生するのではなく、信号が不鮮明になります。 PM / Scl-100およびhXrn1のRNAiサイレンシングを表すレーンで、トランケートされた28S rRNAフラグメントの実質的な蓄積が観察されました(図4NS)。 PM / Scl-100(酵母ではRrp6)は細胞質に存在することが報告されていますが、主に核のエキソソームに関連してヒト細胞の核に見られます(24、25)。したがって、このレーンの対応するシグナルは、核に局在する分解中間体の蓄積の結果である可能性が最も高いです。対照的に、トランケートされた28S rRNAフラグメントの蓄積は、hRrp41でサイレンシングされた細胞ではそれほど劇的ではありませんでした。

アデニル化された28SrRNA分解中間体は、主要なエキソヌクレアーゼのRNAiサイレンシング時に細胞内に有意に蓄積しました。 ((NS)エキソヌクレアーゼKD後のアデニル化されたトランケートされた28SrRNA分子の蓄積を検出するためのPCR標識アッセイの概略図。簡単に説明すると、異なるKD細胞からのRNAのオリゴ(dT)RTに続いて、[32 P]標識遺伝子特異的プライマー(図1に示すように分子の単離に使用したものと同じアスタリスク)を使用したPCRNS)およびアダプターオリゴが実行されました。 ((NS)モックおよびKD HeLa細胞から精製されたRNAをこの分析に供して、ポリアデニル化され断片化された28SrRNAの蓄積を評価しました。 DNAマーカーの移動は左側に示されています(ヌクレオチド番号)。 ((NS)示されたタンパク質がRNAiによってサイレンシングされた細胞からの細胞質または核RNAを、オリゴ(dT)RT-PCR標識に供した。反応から逆転写酵素を省略したコントロールは、各パネルの右端のレーンに示されています。 ((NS)PCR産物がポリアデニル化転写産物に由来することを確認するために、オリゴ(dT)プライムRT-PCRの前にオリゴ(dT)およびRNase Hとのインキュベーションによって細胞質画分のポリ(A)テールを除去するコントロールを実行しました。ラベリング。これにより、RNase Hで処理されたがオリゴ(dT)を含まないhXrn1サンプルと比較して、増幅シグナルがバックグラウンドレベルに減少しました[レーンはhXrn1(-)とラベル付けされています]。

hXrn1は、細胞質における5'-3'RNA分解において中心的な役割を果たします。直感に反して、そのサイレンシングは、ポリアデニル化分子の有意な蓄積をもたらしました。これらの転写産物の細胞質内局在はhXrn1の局在によって暗示されますが、明らかな問題は、なぜ5'-3 'エキソヌクレアーゼの阻害が3'末端ポリ(A)テールを持つ分解中間体の蓄積をもたらすのかということです。この問題は、 議論.

総合すると、このアッセイを使用して得られた情報は、単離されたポリアデニル化28SrRNAフラグメントが実際に分解中間体であることを示唆しています。細胞の位置を明確に決定するために、ここで説明する分析は、核と細胞質の分画後に繰り返されました。また、エクソソームコアがこのプロセスに関与しているかどうかをさらに調査するために、いくつかの追加のサブユニットとエキソリボヌクレアーゼがダウンレギュレーションされました。

エキソリボヌクレアーゼのRNAiサイレンシングにより、ポリ(A)支援RNA崩壊がヒト細胞の細胞質に存在することが確認されました。

一過性にアデニル化されたRNAの分解がヒト細胞の細胞質で起こることを確認するために、核および細胞質画分を調製した後に分析を繰り返した。 2つの追加のエクソソームコアコンポーネントであるhRrp40とPM / Scl-75、および2つのエキソリボヌクレアーゼであるhDis3とhDis3Lがノックダウンされました。 hDis3は、酵母Dis3タンパク質の相同体であり、酵母の核と細胞質の両方のエクソソームに関連する追加のエンドヌクレアーゼ活性を持つ加水分解性3'-5 'エキソリボヌクレアーゼです。このタンパク質は、細胞質酵母エクソソームの唯一の触媒サブユニットとして機能します(25、26)。この作業の進行中に、ヒト細胞で追加のDis3ホモログであるhDis3Lが発見され、hDis3とは異なり、エクソソームコアと強く関連し、細胞質に局在することがわかりました。したがって、それはヒト細胞におけるDis3オルソログである可能性が高く、そのサイレンシングが含まれていました(27)。 2つの追加の酵素がサイレンシングされました:hXrn2とLsm1。前者は主要な核に局在する5'-3 'エキソヌクレアーゼであるため、そのKDは細胞質ではなく核に蓄積を引き起こすと予想されます(4)。 Lsmタンパク質は、細菌のHfqタンパク質と同様の役割を果たし、尾部の付加による細菌のmRNA分解に関与します。 Lsm1は、hXrn1、脱キャップ酵素(Dcp1 / Dcp2)、および細胞質内のmRNA分解に関連しています。また、ヒストンmRNAオリゴ(U)を介した崩壊に直接関与していることが示されました。したがって、そのRNAiサイレンシングの効果も評価されました(28)。適切な抗体がないため、RT-PCRの定量化により、サイレンシングされたタンパク質のmRNAレベルが大幅に低下することが示されました(図3NS).

エクソソーム成分であるhRrp40またはPM / Scl-75がサイレンシングされた細胞の細胞質には蓄積は観察されず、核画分にはわずかな蓄積しか観察できませんでした(図4NS)。対照的に、hDis3またはhDis3LのいずれかのKDは、切り捨てられた28S rRNAフラグメントの明確な細胞質蓄積をもたらし、これら2つのタンパク質が分解プロセスに関与していることを示唆しています。予想通り、hXrn1とPM / Scl-100のサイレンシングは、それぞれ細胞質画分と核画分に実質的な蓄積を引き起こし、hXrn2のKDは核画分にのみ蓄積をもたらしました。 Lsm1のサイレンシングは、どちらの画分にも蓄積しませんでした。ゲルで観察された標識産物が実際にポリアデニル化28SrRNA分子の増幅によって得られ、非特異的逆転写のアーティファクトではないことを確認するために、細胞質から精製したRNAをRNase Hおよびオリゴ(dT)とインキュベートしてからオリゴ(dT )-プライミングされた逆転写(図4NS)。このようにして、すべてのポリ(A)テールが除去され、後続のオリゴ(dT)プライムRT中にcDNAが生成されません。実際、この処理により、観察された増幅シグナルがバックグラウンドレベルまで減少しました。 RNase Hのみ、またはRNase Hとオリゴ(dT)のいずれかとインキュベートしたhXrn1サイレンシング細胞から精製したRNAで得られた結果を比較すると、特に明らかです(図4NS).

総合すると、これらの結果は、rRNAがヒト細胞の核だけでなく細胞質でも一時的にアデニル化される可能性があることを確認しており、これはrRNAの崩壊に関連しています。細胞質では、アデニル化分解中間体がダウンレギュレーション時に蓄積するため、関与するエキソリボヌクレアーゼには、hDis3L、hDis3、およびhXrn1が含まれます。

エクソソームまたはhPNPaseのサイレンシングは、ヘテロアデニル化クローンの割合の減少を引き起こしません。

この段階で、テールの付加に関与する酵素、特にヘテロポリマー性の酵素を特定しようとしました。 PNPaseと古細菌のエクソソームは、細菌、オルガネラ、古細菌のRNAのヘテロテーリングと分解の両方に関与しています(7)。構造的に類似した真核生物のエクソソームは、最初はここで観察されたヘテロ活性の候補であり、ヘテロテールの生成に関与している場合、ホモ伸長に有利なシフトがそのKDで発生すると予想されます。しかし、エキソソームはリン酸分解活性を欠いていると報告されており(25)、これと一致して、単離および配列決定されたクローンの総量内のホモテールの割合は、エキソソームサブユニットhRrp41、PM /のKDでは増加しないことがわかりました。 Scl-100、およびPM / Scl-75(図5)。

エクソソーム成分またはhPNPaseのRNAiサイレンシングを伴うHeLa細胞、VVに感染した細胞、および酵母から単離されたホモポリマーテール分子のパーセンテージ。 HeLa細胞から分離された配列決定された分子の総数に占めるホモポリマーテール分子の割合は、hRrp41、PM / Scl-75、PM / Scl-100、またはhPNPaseのRNAiサイレンシングでは増加しませんでした(28S rRNAを分析しました)。 VVに感染した細胞では、ウイルスのG8RRNAが分析されました。 S. cerevisiae、25S rRNA、CYH2およびActin1(表S3、S4、およびS5)。

PNPaseはヒト細胞に存在し(hPNPase)、リン酸分解的に活性です(29)。ミトコンドリア膜間腔(IMS)(30)に局在していますが、シトクロムCやエンドヌクレアーゼG(31)などの他のIMSタンパク質と同様に、hPNPaseがこのコンパートメントから遊離して細胞質に入る可能性を検討しました(および/または核)、ヘテロテールを重合する可能性があります。しかし、一定のhPNPase shRNAサイレンシングを伴う細胞でもホモテール率の増加は観察されませんでした(32)。


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モルゲン試験4

誘導性オペロンは通常転写されません。それは、負の誘導性オペロンでリプレッサータンパク質を不活性化することによって、または正の誘導性オペロンで活性化タンパク質を刺激することによって、転写を刺激するために誘導分子を必要とする。

(a)mRNAのアクリジン色素誘発性変異。状態は、関与する細胞においてヘテロ接合である。

2.翻訳の禁止

3.転写サイレンシング

2.真核細胞では、クロマチン構造が遺伝子調節に関与しています。凝縮したクロマチンは転写を阻害します。したがって、発現が起こるためには、構造の変化を可能にするためにクロマチンを変更する必要があります。これらの変化には、ヒストンタンパク質のアセチル化とDNAメチル化が重要です。

3.転写開始のレベルでは、プロセスは真核細胞ではより複雑です。真核生物では、開始には、RNAポリメラーゼ、一般的な転写因子、および転写活性化因子を含む複雑な機械が必要です。細菌のRNAポリメラーゼは、調節タンパク質の作用によってブロックまたは刺激されます。

真核生物のプロモーター、近位プロモーターエレメント、エンハンサー、およびサイレンサー。

NS。
適度に反復するDNA
NS。
反復性の高いDNA
NS。
短鎖散在要素
NS。
長鎖散在反復配列
e。
ユニークシーケンスDNA

2.直接修理。 DNA損傷は、損傷したヌクレオチドを元の構造に直接戻すことによって修復されます。

3.塩基除去修復。損傷した塩基を切除し、ヌクレオチド全体を置換します。

4.光反応性修復-紫外線照射によって形成されたピリミジン二量体の逆転。光活性化酵素が必要

5.複製後の修復-DNA複製中に最初のミスマッチ修復を免れた損傷したDNAで発生します。このメカニズムでは、RecAタンパク質は、同じ極性の損傷を受けていない親鎖の対応するものを再結合します

6.二本鎖切断修復-DNAの2本の切断された鎖の付着に関与-は、相同組換え修復と姉妹染色分体の対応する領域をテンプレートとして使用します


真核生物のプレmRNAは、翻訳の準備が整う前に広範な処理を受けます。真核生物のmRNAの成熟に関与する追加のステップにより、原核生物のmRNAよりもはるかに長い半減期を持つ分子が作成されます。真核生物のmRNAは数時間持続しますが、典型的な 大腸菌 mRNAの持続時間は5秒以内です。

プレmRNAは最初にRNA安定化タンパク質でコーティングされ、プレmRNAが処理されて核から排出される間、分解からプレmRNAを保護します。プレmRNAプロセッシングの3つの最も重要なステップは、分子の5 'および3'末端での安定化およびシグナル伝達因子の追加、および適切なアミノ酸を指定しない介在配列の除去です。まれに、mRNA転写物は、転写後に「編集」されることがあります。

5 'キャッピング

プレmRNAがまだ合成されている間、 7-メチルグアノシンキャップ リン酸結合によって成長中の転写物の5 '末端に付加されます。この部分(官能基)は、発生期のmRNAを分解から保護します。さらに、タンパク質合成に関与する因子は、リボソームによる翻訳の開始を助けるためにキャップを認識します。

3 'ポリAテール

伸長が完了すると、プレmRNAはエンドヌクレアーゼによってAAUAAAコンセンサス配列とGUリッチ配列の間で切断され、プレmRNA上にAAUAAA配列が残ります。次に、ポリAポリメラーゼと呼ばれる酵素が、約200A残基のストリングを追加します。 ポリAテール。この修飾はさらにプレmRNAを分解から保護し、転写物が細胞質に必要とする細胞因子の輸出を知らせます。

プレmRNAスプライシング

真核生物の遺伝子は エクソン、タンパク質コード配列に対応します(元-onは、 押された)、および intと呼ばれるerveningシーケンス イントロン (intronは彼らの int遺伝子調節に関与している可能性がありますが、処理中にプレmRNAから除去されます。 mRNAのイントロン配列は機能性タンパク質をコードしていません。

イントロンの発見は、原核生物で観察されたように、プレmRNAがそれ以上の処理なしにタンパク質配列を特定することを期待していた1970年代の研究者にとって驚きでした。高等真核生物の遺伝子には、1つまたは複数のイントロンが含まれていることがよくあります。これらの領域は調節配列に対応している可能性がありますが、遺伝子内に多くのイントロンを持っている、または非常に長いイントロンを持っていることの生物学的重要性は不明です。多くのイントロンでプレmRNAを転写するのに時間がかかるため、イントロンが遺伝子発現を遅くする可能性があります。あるいは、イントロンは、進化を通して古代の遺伝子の融合から残された非機能的な配列の残骸である可能性があります。これは、別々のエクソンが別々のタンパク質サブユニットまたはドメインをコードすることが多いという事実によってサポートされています。ほとんどの場合、イントロンの配列は、最終的にタンパク質産物に影響を与えることなく変異させることができます。

タンパク質合成の前に、mRNA以前のすべてのイントロンを完全かつ正確に除去する必要があります。プロセスが1ヌクレオチドでもエラーになると、再結合したエクソンのリーディングフレームがシフトし、結果として生じるタンパク質が機能しなくなります。イントロンを除去し、エクソンを再接続するプロセスは、 スプライシング (図1)。プレmRNAがまだ核内にある間に、イントロンが除去されて分解されます。スプライシングは、イントロンが除去され、エクソンが単一ヌクレオチドの精度と精度で再結合することを保証する配列固有のメカニズムによって発生します。プレmRNAのスプライシングは、スプライセオソームと呼ばれるタンパク質とRNA分子の複合体によって行われます。

練習用の質問

図1.プレmRNAスプライシングには、一次RNA転写産物からのイントロンの正確な除去が含まれます。スプライシングプロセスは、タンパク質とsnRNAと呼ばれるRNA分子で構成されるスプライセオソームと呼ばれるタンパク質複合体によって触媒されます。スプライセオソームは、イントロンの5 'および3'末端の配列を認識します。

スプライシングのエラーは、癌やその他の人間の病気に関係しています。どのような種類の変異がスプライシングエラーにつながる可能性がありますか?

70を超える個々のイントロンが存在する可能性があり、単一の翻訳可能なmRNA分子を生成するために、それぞれが5 'キャッピングとポリAテールの追加に加えてスプライシングのプロセスを経る必要があることに注意してください。

トリパノソーマでのRNA編集

図2。 ブルーストリパノソーマ 人間の睡眠病の原因物質です。この病原体のmRNAは、タンパク質合成が起こる前にヌクレオチドを追加することによって変更する必要があります。 (クレジット:Torsten Ochsenreiterによる作業の変更)

トリパノソーマは、病原体を含む原生動物のグループです ブルーストリパノソーマ、これは人間に睡眠病を引き起こします(図2)。トリパノソーマ、および事実上他のすべての真核生物には、細胞に化学エネルギーを供給するミトコンドリアと呼ばれる細胞小器官があります。ミトコンドリアは、独自のDNAを発現する細胞小器官であり、真核生物と飲み込まれた原核生物との共生関係の残骸であると考えられています。トリパノソーマのミトコンドリアDNAは、セントラルドグマに興味深い例外を示しています。それらのプレmRNAには、機能性タンパク質を特定するための正しい情報がありません。通常、これはmRNAがいくつかのUヌクレオチドを欠いているためです。セルは、これを改善するためにRNA編集と呼ばれる追加のRNA処理ステップを実行します。

ミトコンドリアゲノムの他の遺伝子は、40〜80ヌクレオチドのガイドRNAをコードしています。これらの分子の1つまたは複数は、プレmRNA転写物のヌクレオチドのいくつかと相補的な塩基対形成によって相互作用します。ただし、ガイドRNAにはプレmRNAよりも多くのAヌクレオチドがあり、結合するUヌクレオチドがあります。これらの領域では、ガイドRNAがループアウトします。ガイドRNAの3 '末端には長いポリUテールがあり、これらのU塩基は、ガイドRNAがループするプレmRNA転写産物の領域に挿入されます。このプロセスは完全にRNA分子によって媒介されます。つまり、タンパク質ではなくガイドRNAがRNA編集の触媒として機能します。

RNAエディティングはトリパノソーマの単なる現象ではありません。一部の植物のミトコンドリアでは、ほとんどすべてのプレmRNAが編集されています。 RNAエディティングは、ラット、ウサギ、さらには人間などの哺乳類でも確認されています。プレmRNAプロセッシングにおけるこの追加のステップの進化的理由は何でしょうか?一つの可能​​性は、古代の原核生物の残骸であるミトコンドリアが、遺伝子発現を調節するための同様に古代のRNAベースの方法を持っているということです。この仮説を支持するために、プレmRNAに対して行われる編集は細胞の状態によって異なります。推測的ではありますが、RNA編集のプロセスは、タンパク質ではなくRNA分子が反応の触媒作用を担っていた原始時代からの引き継ぎである可能性があります。


結果

まず、miRNA依存性の分解に敏感な転写産物を生成しました。 mir6.1バックボーン(Chen et al。、2007)に基づいて、 ショウジョウバエ E-RNAi(Horn&amp Boutros、2010)およびGESS(Yilmazel et al。、2014)プログラム、およびガイド配列のヌクレオチドBLAST検索によって決定されたゲノム キイロショウジョウバエ ゲノム(FB2016_04リリース)。人工miRNAは、の3'UTRイントロンに挿入されました。 mKate2 miRNAコンストラクトの発現をモニターできる遺伝子。末端指向の分解や翻訳阻害ではなく、miRNAによる切断を促進するために、miRNAの3つの完全に相補的な標的部位(Ameres&amp Zamore、2013)がホタルルシフェラーゼの3'UTRに組み込まれました(FLuc)レポーター遺伝子。予想通り、 FLuc レポーターとmiRNAコンストラクトは、の発現と比較してFLucタンパク質レベルの大幅な減少をもたらしました FLuc レポーターコンストラクトのみ(100%から5.3±0.4%、図1A)。

miRNAを標的とした転写産物を分解から救うことができるかどうかを判断するために、miRNA標的部位のすぐ5 '側、およびコード配列の下流に139塩基のポリ(A)トラクトを配置しました。 FLuc。レポーター転写産物のmiRNA誘導エンドヌクレアーゼによる切断に続いて、カット転写産物の新しく作成された3 '末端に位置する内部ポリ(A)トラクトが、3'から5 'へのエキソヌクレアーゼ分解からより多くの5'配列を保護し、翻訳(Wilusz、Wormington&amp Peltz、2001)。内部poly(A)トラクトの追加 FLuc レポーターは、FLuc発現のわずかな減少を引き起こしました FLuc poly(A)トラクトのないレポーター(100%から89.9±6.5%図1A)。ただし、miRNAと FLuc レポーターコンストラクトが共発現していることがわかりました。 FLuc 内部poly(A)トラクト(つまり、poly(A)+)を持つレポーターは、よりもはるかに高いレベルのFLuc発現をサポートしていました。 FLuc 内部ポリ(A)トラクト(すなわち、ポリ(A)-)を欠くレポーター:それぞれ81.4±4.0%および5.3±0.4%(図1A)。

レポーター転写産物が人工miRNAによって切断されたかどうかをテストするために、miRNAとpoly(A)+またはpoly(A)-レポーターを発現する細胞からRT-PCR分析を行いました。第1鎖cDNAは3 '位からmiRNA標的部位に逆転写されました。内のより5 '領域 FLuc 次に、コード領域をPCRを使用して増幅しました(図1B)。このような実験では、PCR産物の量はノーカットのレベルに比例する必要があります FLuc トランスクリプト。図1Cに示すように、miRNAを添加すると、 FLuc 転写産物に内部ポリ(A)トラクトが含まれているかどうかに関係なく、no-miRNAコントロールと比較したRT-PCR産物。 miRNAの存在は、ポリアデニル化されたmRNAの総レベルにも影響しませんでした。 ショウジョウバエ からの非標的転写物のRT-PCRによって測定されたS2細胞 βグルクロニダーゼ (βGlu)遺伝子(図1C)。総合すると、これらの結果は、内部ポリ(A)トラクトがより3 'の位置で切断された転写物を安定化するモデルと一致しています。このモデルを念頭に置いて、翻訳がブロックされた転写産物の構築に着手しましたが、miRNA依存性の切断によって遊離する可能性があります。

mRNAの5'-UTRの二次構造は、多くの状況でmRNAの翻訳を抑制することができます(Kozak、2005 Lammich et al。、2011)。我々は、3'UTRでの切断によって緩和または形成を防ぐことができる2次構造を5'UTRに構築しようとしました。これを行うために、2つの異なるRNA分子間の相互作用によって安定したRNA構造が生成される自然発生のシステムに目を向けました。 CopTとCopAは、よく特徴付けられた細菌のRNA分子です。それぞれがヘアピンを形成し、90ヌクレオチド以上の相補性を共有します。バクテリアでは、CopAは結合します トランスで のリーダー地域にあるCopTへ repA、の翻訳を防ぐ構造を形成する repA mRNA(Blomberg et al。、1994 Blomberg、Nordstrom&amp Wagner、1992)。ペアリングは、一時的なループ間相互作用(キス複合体)から始まり、安定した構造である4ヘリックスジャンクションに進みます(Kolb et al。、2000a Kolb et al。、2000b)。この構造は、リボソームのリボソーム結合部位へのアクセスをブロックします repA mRNA(Blomberg et al。、1994)。 CopTとCopAがそれぞれ同じ転写産物の5 'と3'UTRにある場合、それらの結合から生じる二次構造の形成は、介在するコード配列の翻訳を妨げるだろうと仮定しました。

このアイデアを探求するために、CopTまたはCopAを単独で、または組み合わせて導入しました。 FLuc トランスクリプト。の5'UTRへの単一のCopTの導入 FLuc mRNAはFLuc発現の低下を引き起こしましたが(図2A–2B:2)、転写物の3'UTRに単一のCopAを配置しても、FLuc発現に有意な影響はありませんでした(107.7±26.1%)。図2A–2B:3)。開始コドンの上流に配置されているが3'UTRには配置されていない強力なヘアピン構造が翻訳開始を妨げることが多いため、これらの結果は予想されます(Kozak、2005)。ただし、重要なことに、CopTとCopAを同じUTRの5 'および3'UTRに挿入すると、FLuc発現の大幅な低下が観察されました。 FLuc それぞれ転写物(100%から2.8±0.7%図2A–2B:4)。ヘアピン構造が一方、両方、またはまったく存在しない場合、転写レベルは類似していたため、このサイレンシングは翻訳の阻害が原因である可能性があります(図2C)。

これらの観察結果を踏まえて、miRNAがCopAとCopTの間の相互作用を妨害または防止することにより、mRNA翻訳の阻害を抑制解除または防止できるかどうかを尋ねました。以前にテストした人工miRNAの3つの標的部位(図1)がCopAの上流に配置された転写産物を生成しました。 FLuc 両方のヘアピン構造を持つ転写産物(図2A:4)。さらに、ポリ(A)トラクトがコード配列の3 '末端の間に挿入された FLuc およびmiRNAターゲットサイト。この配置により、カットが保証されます FLuc 転写物は、3 '末端に露出したポリ(A)トラクトを持っています。このコンストラクトは、以降、miRNAレポーターと呼ばれます(図3A)。 miRNAレポーターの有効性を評価するために、それからのFLuc発現を、3'UTRのCopAが同じ長さのランダム配列(レポーターCopA-)で置き換えられたコントロール転写産物からの発現と比較しました。レポーターCopA-は、CopA-CopTを介した抑制がない場合のFLuc発現の測定値を提供するため、miRNAを使用した場合と使用しない場合のレポーターパフォーマンスのリファレンスとして機能します。

私たちはの翻訳が FLuc miRNAレポーターからのレポーターは、レポーターCopA-と比較して強く抑制されていました(100%から4.4±0.5%、図3B)。この抑制は、miRNAの共発現によって劇的に減少しました(4.4±0.5%から41.9±4.2%)。 miRNAとレポーターCopA-の共発現は逆の効果がありました:FLuc翻訳はわずかに低下しました(100%から84.0±3.5%に図3B)。最も重要なことは、RT-PCR分析は、miRNAの存在が、miRNAを含まないコントロールと比較して、切断されていないmiRNAレポーター転写産物のレベルを大幅に低下させる一方で(100%から43%、図3C)、 FLuc miRNA発現細胞からの細胞は、no-miRNAコントロールの10倍に増加しました(図3B)。これらの観察結果を総合すると、特定の標的部位でのレポーターの転写産物のmiRNA誘導切断は、翻訳抑制を逆転または防止し、その結果、正の翻訳読み出しを備えたmiRNA切断レポーターが得られると主張しています。


RNA(リボ核酸):構造と種類(図付き)

RNAの一次構造はDNAと同じです。また、5&#8242-3&#8242糖リン酸リンクを持つポリヌクレオチド鎖でもあります。しかし、糖はリボースであり、一般的に一本鎖分子として存在します。そのため、相補的な塩基間の比率は1対1ではありません。プリンの量はピリミジンの量と同じではありません。

RNAの4つの主要な塩基の1つは、チミンの代わりにウラシル(U)です。 RNAの生物物理学的特性は、二次構造がはるかに少ないことを示しています。しかし、塩基の配列の後に同じ鎖内の相補的な配列が続く場合、ポリヌクレオチドはそれ自体で折り返され、ヘアピンとして知られる逆平行二重構造を生成する可能性がある。

ステム、塩基対の二重らせん領域、および一端に対になっていない塩基を持つループがあります(図3.55)。これらの地域では、GはUとペアリングすることもできますが、G-Cペアほど強力ではありません。

細胞には、3種類のRNAメッセンジャーRNA(mRNA)、リボソームRNA(rRNA)、およびトランスファーRNA(tRNA)が含まれています。メッセンジャーRNAはタンパク質合成のテンプレートとして機能します。それは非常に不均一なクラスの分子であり、非常に不安定です。これは、正常細胞の全RNAの2&#82115パーセントを構成します。それはハーシー(1956)によって最初に検出されました。メッセンジャーRNAの名前と概念は、F。JacobとJ. Monod(1961)によって最初に与えられました。

溶融したDNAを特定のm-RNAでゆっくりと冷却すると、DNA-RNAハイブリッド分子が形成されます。これは、m-RNAがDNA二重鎖のテンプレート鎖から形成されていることを示唆しています。

遺伝子または遺伝子のグループの長さが異なるため、サイズは非常に不均一です。原核生物では、mRNAが5&#8242から3&#8242の方向に転写および翻訳され、両方のプロセスが核膜によって分離されていないため、mRNA分子の翻訳はその転写が完了する前に開始されることがよくあります。

(私) mRNAの構造 :

メッセンジャーRNAはタンパク質のアミノ酸配列をコードします。個人の特定の生命段階における特定の細胞内の異なるmRNA種(トランスクリプトミクス= mRNAプロファイル)の数と種類は、その段階で細胞内に存在する異なるタンパク質(プロテオミクス=タンパク質プロファイル)の数に匹敵します。メッセンジャーRNAは全細胞RNAの1%から2%を構成します。

すべてのmRNAは特定の特性を共有しています。

(a)特定のポリペプチドをコードするヌクレオチドの連続配列を含む

(b)それらは細胞質に見られ、

(c)それらはリボソームに付着しているか、翻訳されるためにそのような付着が可能です。

(d)ポリペプチドで観察された分子量の範囲と一致して、mRNAの長さは数百ヌクレオチドから数千ヌクレオチドまで変化します

(e)一部のmRNAの代謝回転速度は非常に遅いものの、mRNAは一般にrRNAやtRNAよりも不安定です。

ほとんどのmRNAには、重要な非コードセグメント、つまりアミノ酸の集合を指示しない部分が含まれています。たとえば、各グロビンmRNAの約25%は、非コード、非翻訳領域(UTR)で構成されています。ノンコーディング部分はメッセンジャーRNAの5&#8242と3&#8242の両方の末端にあり、重要な調節的役割を持つ配列を含んでいます。

非コードヌクレオチドに加えて、真核生物のmRNAは、原核生物のメッセージには見られない5&#8242および3&#8242末端に特別な修飾があります。真核生物のmRNAの5&#8242末端にはメチル化グアノシン&#8220cap&#8221があり、3&#8242末端にはポリ(A)テールを形成する50〜250のアデノシン残基のストリングがあります。

開始コドンと終止コドンの間の配列は、オープンリーディングフレーム(ORF)を構成します。長さが大きく変動する5&#8242および3&#8242の非翻訳領域に隣接しています。その結果、mRNAの長さはそれがコードするアミノ酸配列の長さと常に相関するとは限りません。

5&#8242および3&#8242 UTRの正確な機能は、多くのmRNAでまだ十分に理解されていませんが、多くの場合、これらの領域には、mRNAの輸送、翻訳、安定性を調節する二次構造を形成し、タンパク質と相互作用できるRNA配列が含まれています。

3&#8242ポリアデニル酸テールはDNAにコードされていませんが、mRNAが核から細胞質にエクスポートされる前に転写後に追加されます。エンドヌクレアーゼとポリ(A)ポリメラーゼを含む酵素複合体は、転写産物の3&#8242末端近くのシグナル配列(5&#8242&#8211 AAUAAA&#8211 3&#8242)を認識し、シグナルの下流でプレmRNAを切断します。 、および3&#8217endに20〜250のアデノシン残基を追加します。

色素体およびミトコンドリアのmRNAの構造は、細胞質のmRNAの構造とは異なります。オルガネラmRNAは、5&#8242キャップとポリ(A)テールの両方を偽造します。転写後RNA処理の違いの結果として、ミトコンドリアmRNAは一般に5&#8242三リン酸基を保持しますが、ほとんどの色素体mRNAの5&#8242末端は一リン酸化されています。

原核生物のmRNAと同様に、ほとんどのオルガネラmRNAの5&#8242-および3&#8242-UTRは、調節機能と安定化機能を持つステムループ構造を形成できます。これらのRNA構造はしばしばタンパク質と相互作用し、mRNAの処理、翻訳、分解に影響を与えるシグナルとして機能します。

真核細胞には、追加のクラスの小さくて安定したRNAが含まれています。安定したウリジンに富むRNAは、核内低分子リボ核タンパク質(UsnRNP)の成分であり、真核生物の核内低分子RNA(snRNA)の主要なクラスを構成します。これらのRNAはU1以降に番号が付けられています。一部のsnRNAは核質内で高いコピー数で発生し、主要なsnRNAとして知られています。

マイナーなsnRNAのほとんどは核小体に見られるため、snoRNA(核小体低分子RNA)と呼ばれます。 snRNPのほとんどのsnRNAは、核内の前駆体mRNAからの介在する非コード領域のスプライシングに関与しています。

他のsnRNAは、ポリ(A)テールを欠くヒストンプレmRNAの3&#8242末端の処理に関与します。ほとんどのsnoRNAは、rRNA前駆体の処理に関与しています。

真核生物では、転写は核のプロセスであり、翻訳は細胞質のプロセスであるため、転写と翻訳は同時には行われません。新たに転写されたmRNAは一次遺伝子転写物と呼ばれ、核から細胞質に輸送されます。

真核生物の機能的mRNAは、次のようないくつかのタイプの処理を通じて一次遺伝子転写物に由来します。

(a)プレmRNAまたは大きなmRNA前駆体の小さな個々のmRNA分子への切断。

(b)分子の5&#8242末端への7-メチルグアノシン基のキャッピングまたは追加。

(c)ポリ(A)テーリングまたは200ヌクレオチド長のアデニル酸ヌクレオチド配列のmRNA分子の3&#8242末端への付加。

(d)特定のタンパク質との複合体の形成。

5&#8242の終わりから開始コドンまでの塩基配列はリーダー配列と呼ばれ、介在する非コード配列はイントロンと呼ばれます。タンパク質に翻訳されるコード配列はエクソンと呼ばれます。一次転写物の処理には、イントロン配列の除去が含まれます。

個々の遺伝子転写物の転写後修飾は、上記の4種類のプロセシングの一部またはすべてを受ける可能性があります。

真核細胞の核で合成される非リボソームRNAのほとんどは非常に大きく、サイズが大きく変動し、異種核RNA(hnRNA)またはプレmRNAと呼ばれます。

転写直後に核内でこれらの巨大分子が急速に処理されると、mRNA分子が形成され、核から細胞質に輸送されます。処理中に、一次転写産物からイントロンがスプライシングされます。

スプライシングメカニズムには、次の3つの異なるタイプがあります。

(a)エンドヌクレアーゼおよびリガーゼ酵素によるtRNA前駆体のスプライシング。

(b)テトラヒメナRNA前駆体の自動スプライシングは、RNA分子自体によって触媒される独特の反応メカニズムです(自己スプライシング)。これらの触媒RNA分子はリボザイムと呼ばれます。このようなタイプのスプライシングメカニズムでは、タンパク質酵素は関与していません。

この自己触媒活性は、いくつかの下等真核生物のrRNA前駆体、および多くの異なる種のミトコンドリアと葉緑体の多数のmRNA、tRNA、およびmRNA前駆体でも発生することが示されています。

(c)プレmRNA転写物のイントロンは、スプライシオソームと呼ばれるリボヌクレオプロテイン複合体によって触媒される2段階の反応でスプライシングされます。

植物の核プレmRNAのイントロンはさまざまで、AUが豊富である傾向があり、スプライスジャンクションで配列が保存されています。双子葉植物では、これらのイントロンには70%のAUが含まれていますが、単子葉植物では60%です。各エクソン-イントロン接合部を取り巻くヌクレオチド配列は高度に保存されています。

植物のほとんどすべての核mRNAイントロンにおいて、5&#8242スプライス部位(ドナー部位)と3&#8217スプライス部位(アクセプター部位)の境界配列は、5&#8242GUとAG3&#8242で構成されています。この特性は、GU-AGルールとして知られています。追加の構造要素である分岐部位は、通常、3&#8217スプライス部位から20〜40ヌクレオチド上流に位置しています。

イントロンの切除中、イントロンの5&#8217末端は分岐部位のアデニン残基に結合し、ラリアットを形成します。プレmRNAイントロンスプライシングは、snRNA U1、U2、U4 / U6複合体、および115を含む大きなリボ核タンパク質複合体(スプライセオソーム)内で発生します。これらは、小さなリボ核タンパク質(snRNP)および非snRNPタンパク質因子(図3.58)。

以下の表に、4つの主要なタイプのイントロンを示します。

自己スプライシングのメカニズムは、イントロンのグループによって異なります。グループ1イントロンのスプライシングは、グアノシン分子または5&#8242リン酸化誘導体がイントロン配列に結合したときに開始されます。結合したグアノシンの3&#8217OH基は、5&#8217スプライス部位のリン酸基を攻撃し、その部位のホスホジエステル結合を切断してエクソン-1を放出します。

エキソン-1の末端にある3&#8242 OHは、3&#8217スプライス部位でリン酸と反応し、2つのエキソンを連結して、線形イントロンを放出します(図3.59)。グループIIイントロンの自己スプライシングメカニズムは、核のプレmRNAのスプライシングに似ていますが、スプライセオソームの形成は含まれていません。これらのスプライシング反応は通常、分子内であり、単一の転写産物からエクソンを結合し、シススプライシングと呼ばれます。

対照的に、植物の特定のグループIIイントロンは、2つ以上のRNA分子が関与する新しいトランススプライシングメカニズムによって除去されます。それは植物の葉緑体とミトコンドリアに見られます。 RNAポリメラーゼIIIによって転写される特定の種の小さくて安定したRNAだけが、大規模な処理を受けません。

RNAの種類:

(i)リボソームRNA :

細胞RNAの大部分はリボソームRNAです。リボソームの主成分ですが、タンパク質合成におけるその明確な役割は明らかではありません。植物、藻類、光合成原生生物にはそれぞれ、細胞質、色素体、ミトコンドリアの3つのクラスのリボソームが含まれています。大腸菌リボソームでは、3種類のrRNAが見られます。それらは、沈降挙動のために5S、16S、および23Sと呼ばれます。

各リボソームには、これらのrRNA種のそれぞれの1つの分子が含まれています。ただし、真核生物のリボソームには、5S、7S、18S、および28SのrRNA種がそれぞれ1分子含まれています。リボソームRNAは、細胞内の3種類のRNAの中で最も豊富です。

リボソームRNAは一本鎖ですが、相補領域とヘアピンループの間に二本鎖が形成されるため、高度な二次修飾も示します。各ループには二重ステムが含まれています。ループとステムは、タンパク質合成のためのさまざまなリボソームタンパク質やその他の酵素に特異的なベクトル結合部位を提供します。

大腸菌から単離された16SrRNAの3&#8242末端には、30SリボソームのmRNA結合部位として機能するシャインダルガルノ配列があります。この配列は、mRNAの開始端を認識するのに役立ちます。 5S rRNAは、すべてのtRNAのTΨC配列に相補的な配列を持っています。したがって、5SRNAはtRNAのリボソームへの結合に不可欠です。

pre-rRNAの処理には、核酸分解による切断とメチル化が含まれます。一部の真核生物のrRNA転写産物は、イントロン自体によるスプライシングを受けます(自己スプライシング、リボザイム)。

17S、5.8S、および25S rRNA分子をコードする核rRNA遺伝子クラスターの転写ユニットは、RNAポリメラーゼIによって単一の長い前駆体分子に転写され、その後、一連の切断およびメチル化ステップを経て17S、5.8Sが生成されます。 、および25SrRNA分子。

対応する核遺伝子からの5SrRNAの転写は独立しており、RNAポリメラーゼIIIによって触媒されます。処理は不要です。

17S、5.8S、および25S rRNAは、いくつかのRNaseによって触媒される反応を処理することにより、一般的な45SrRNA前駆体分子から生成されます。処理中、25Sおよび5.8S rRNAは水素結合し、処理が完了した後もペアのままになります(図3.60)。

4つのプラスチドrRNA分子は、ポリシストロン性転写ユニットとしてコード化されています。これには、16Sと23SrRNAを分離するスペーサー領域にtRNAalaとtRNAlleをコードする2つのtRNA遺伝子も含まれ、それぞれに長いイントロンが含まれています。複雑なプロセシング経路を介して、前駆体RNAは16S、23S、4.5S、および5SrRNAとtRNA前駆体に切断されます。

次に、切断されたtRNA前駆体は、機能的なtRNAlleおよびtRNAala分子に処理されます。 tRNAは核遺伝子のクラスターからRNAポリメラーゼIIIによって転写されますが、5S rRNAとは異なり、プロセシングが必要です(図3.61)。

(ii) RNAを転送する :

トランスファーRNAは、4Sで沈降するRNAの一部として最初に同定されました。 tRNAは75-85ヌクレオチドの長さです。それらは可溶性RNAまたは細胞質RNAとしても知られています。トランスファーRNAは二重の機能を果たすアダプター分子です。コドンとアミノ酸の両方を認識します。

tRNAのヌクレオチド配列はクローバーの葉の形をします。この構造では、相補的な対の塩基が一本鎖ループのステムを形成します。ステムとループの構造はtRNAのアームとして知られています。

tRNA分子の塩基配列は、1965年にRobert Holleyによって最初に決定されました。通常のA、G、C、およびUを除いて、シュードウリジン(Ψ)、ジヒドロウリジン(H2U)、リボチミジン(rT)、イノシン(I)、アデノシンおよびグアノシンのモノおよびジメチル誘導体、およびそれらのチオール化誘導体。

これらの変更は、ポリリボヌクレオチド鎖に組み込まれた後にのみ、4つの塩基の1つで行われます。 tRNA分子には4つのループと4つの主要なアームがあります。腕はその構造と機能にちなんで名付けられています。

常に対になっていない-C-C-で終わる塩基対のステムからなるアクセプターアーム。その遊離の3&#8242 OH基がアミノアシル化され、5&#8242末端が一般にGまたはCで終わる配列。

他のアームは、ペアのステムとペアのないループで構成されています。 Dアームは、ジヒドロウラシルベースの存在にちなんで名付けられました。アンチコドンアームには、常にループの中央にアンチコドントリプレットが含まれています。 TΨCアームは、このトリプレット配列の存在にちなんで名付けられました。

tRNAの可変機能は、TΨCとアンチコドンアームの間にあるいわゆるエクストラアームであり、その性質に基づいて、tRNAは2つのタイプに分類されます&#8211クラスI tRNA(小さなエクストラアームを持つ)とクラス-II tRNA(大きな余分な腕を持っている)。クローバーの葉の周りの時計回りの方向には、アクセプターステムに常に7塩基対、TΨCアームに5つ、アンチコドンアームに5つ、通常はDアームに3つあります。

核tRNAイントロンの位置は保存されていますが、それらの配列は保存されていません。エンドヌクレアーゼはイントロンの両端でpre-tRNAを切断し、5&#8242 tRNAセグメントの3&#8242末端に環状2&#8242、3&#8242-リン酸基、および遊離5&#8242を形成します。 -3&#8242tRNAセグメントのヒドロキシル基。

環状リン酸基は切断されて2&#8242-リン酸基を形成します。次に、遊離の5&#8242ヒドロキシル基がリン酸化され、両方の半分がRNAリガーゼによって結合されます。 2&#8242-ホスファターゼは2&#8242-リン酸基を除去して、成熟したスプライシングされたtRNAを生成します。


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議論

この研究は、細胞へのおよび細胞からの輸送が拡散による低分子量分子によって誘発される発現系における組換えmRNA崩壊をモニターするために使用できるqRT-PCRベースのアプローチを提示しました。このかなり単純な技術は、抗生物質リファンピシンによる細菌のRNAポリメラーゼの全体的な阻害を伴う、mRNAの安定性にアクセスするための他のほとんどの方法とは対照的に、処理された細胞に最小限の影響しか与えません[50]。後者のアプローチは、おそらく未知の負の副作用を引き起こす可能性があり、さらにリファンピシン非感受性プロモーターが報告されています[48]。

の分析 bla 関連する5&#x02032-UTRは、LV-2およびLII-11変異体による転写レベルの刺激が、より安定したmRNAではなく、転写速度の向上に基づいていることを直接示しました(図1)。また、LII-11バリアントによって文書化されているように、他の遺伝子で報告されているように、より効率的な翻訳が必ずしも転写産物の分解に対するより良い保護をもたらすとは限りません[37]、[51]。しかし、これらの報告に従って、ヒト遺伝子の5&#x02032末端にインフレームで融合した転座シグナル配列がそのmRNAの安定性を刺激できることをここで示しました(図4)。これらの予測できない違いは、おそらく、転写、mRNA分解、および翻訳の間の関係の複雑さの結果です。 5&#x02032シグナル配列を追加すると、mRNAの折り畳みに影響を与える可能性があり、RNaseEを介したmRNAの崩壊に影響を与える場合と影響を与えない場合があります。あるいは、5&#x02032融合の場合に観察された転写物量の増加とmRNA半減期の延長は、より効率的な翻訳開始によるリボソームの翻訳による転写物の保護の可能性を示している可能性があります。たとえば、翻訳されたmRNAのリボソーム密度を定量分析するための新しい技術の使用によるさらなる研究[52]は、より詳細な洞察を得るために使用できる可能性がありますが、一般に、根本的なメカニズムを解明することは非常に複雑であると考えています現在利用可能な技術による。

と同様に bla 関連する5&#x02032-UTRバリアント、同義変異の導入 bla 5&#x02032コード配列は、mRNAの安定性に明らかに影響を与えることなく、蓄積された転写レベルの増加をもたらしました(図3)。この理由は、LV-2 UTR変異の影響の根底にある理由と類似している可能性があります[14]が、遺伝子のコード配列が転写自体にそのような影響を与える可能性があることは興味深いことです。 5&#x02032コード領域は、そのmRNAの二次構造とコドン使用法を介して翻訳の制御に複数回リンクされていますが[53]、[54]それが転写にどのように影響するかについてはほとんど知られていません。隣接する5&#x02032-UTR DNA領域は、&#x003c3 70依存性の転写一時停止を誘導できる&#x0221210プロモーターエレメント(TATAAT)に似た配列を介して、転写プロセスに影響を与える可能性があることが示されています[55]、[56 ]。トリプトファナーゼオペロンの場合(tna)、転写休止部位は、TnaCリーダーペプチドとTnaAトリプトファナーゼのコード領域を分離する220ヌクレオチドの長いスペーサー領域に記載されており、翻訳と転写のカップリングに関係している[57]。したがって、1つの可能性は、 bla コーディング領域は野生型の一時停止部位に影響を与える bla 転写を刺激する方法でのDNA配列。

mRNAの安定性を評価するための新しい方法論の一般的な関連性を実証するために、IPTG誘導性プロモーターにもその使用を拡大しました。 mRNAの崩壊(ompA-gm-csfgm-csf、図5)から生成された NSタック プロモーターは、この方法論がこのIPTG誘導性システムにも同様に有用であることを確認しました。 NS-トルエート誘導性XylS /Pm システム。この方法の潜在的な制限の1つは、バックグラウンド発現レベルが低い誘導性プロモーターの使用が必要なことです。研究中のmRNAのバックグラウンド生成は、実際の崩壊とあるレベルの新しい転写産物合成の混合につながる可能性があり、相対的な崩壊率の計算にエラーを引き起こします。

インデューサーウォッシュアウト法は、低いコピー数(例:pIB11)と適度に高いコピー数(例:pGM29)の両方を持つプラスミドでテストされました。 qRT-PCRは一般的に非常に特異的で感度の高い技術と見なされていることを考えると、この方法はさまざまな発現レベルに問題なく対処できると考えています。さらに、転写レベルおよびそれぞれのタンパク質量の決定と一緒に使用する場合、インデューサーウォッシュアウト法は、組換え遺伝子の全体的な発現レベルに影響を与える可能性のあるさまざまな要因を解明するのに役立つはずです。ここで説明する概念は、分子生物学の研究で頻繁に使用される基本的にすべての細胞型(一部の真核生物でさえ)の遺伝子のmRNA分解を測定するために使用できる可能性が最も高いです。その理由は、拡散性インデューサーに基づくシステムがほぼ普遍的に利用可能であるためです。目的の遺伝子が何であれ、それはそれ自身のUTRでPCR増幅され、次に誘導性プロモーターの下流に挿入されます。これにより、遺伝子が局在する自然環境からのものと同じ転写物が得られる可能性があります。


ビデオを見る: DNA vs RNA Updated (六月 2022).


コメント:

  1. Ferisar

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